16 SrRNA PCR在臨床診斷及流行病調查中的應用

簡介

16 SrRNA PCR在臨床診斷及流行病調查中的應用是采用16S rRNA基因克隆文庫的方法分析菌群組成已廣泛應用于環境和臨床微生物中，它既可以分析標本中細菌的種類，又可以反映標本中各種細菌的相對比例，可以相對定量。

原理

16 SrRNA PCR在臨床診斷及流行病調查中的應用的基本原理是細菌的核糖體RNA (rRNA)按沉降系數分為5S、16S 和23S,其編碼基因(rDNA) 長度依次為120個、1540個及3300個核苷酸。

典型的原核生物大腸桿菌核糖體是由50S大亞基和30S小亞基組成的。在完整的核糖體中，rRNA約占2/3,蛋白質約為1/3。50S大亞基含有34種不同的蛋白質和兩種RNA分子，相對分子質量大的rRNA的沉降系數為23S,相對分子質量小的rRNA為5S。

30S小亞基含有21種蛋白質和一一個16S的rRNA分子。rRNA基因由保守區和可變區組成，在細菌中高度保守。rRNA基因包含5'端到3'端的若干種成分，分別是16S rDNA、間區、23SrDNA、間區和5SrDNA。

16SrDNA基因是細菌染色體上編碼16SrRNA相對應的DNA序列，它集保守性和變異性于一身，存在于所有細菌的染色體基因組中。

用途

16 SrRNA PCR可用于細菌的檢測、鑒定、監測及系統進化研究。

材料與儀器

器材：臨床標本DNA/RNA提取試劑盒，細菌基因組提取試劑盒，普通PCR試劑盒，熒光定量PCR試劑盒，反轉錄PCR試劑盒，PCR產物回收試劑盒，DNA測序儀等。

步驟

獲得目的16S rDNA有兩種方法(見圖12-6)。

（一）從基因組直接擴增法

A. 從微生物樣品中直接提取總DNA對已知的純培養的微生物可通過培養富集后再進行提取。

①細菌培養:將細菌接種于5 ml液體培養基中，37 °C搖床(300 r/min) 培養過夜。
②細菌收集:取1 ml培養物于1.5 mlEP管中，室溫8000 r/min離心5 min,棄上清，沉淀重新懸浮于1 ml TE (pH8.0)中(用ddH2O也行)。
③菌體裂解:加入6 μl 50 mg/ml的溶菌酶，37 °C作用2 h。

再加2 mol/L NaCl 50 μl、10% SDS 110 μl、20 mg/ml 的蛋白酶K 3 μl，50 °C作用3 h或37 °C過夜。(此時菌液應為透明黏稠液體)
④抽提:菌液均分到兩個1. 5 ml EP管，加等體積的酚~氯仿-異戊醇(25 : 24 : 1)，混勻,室溫放置5~ 10 min。

12000 r/min 離心10 min。 抽提兩次。(上清很黏稠，吸取時應小心，最好槍頭尖應剪去)
⑤沉淀:加0. 6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min。12000 r/min 離心10 min。
⑥洗滌:沉淀用75% 的乙醇洗滌。
⑦抽(涼)干后，溶于50 μlddH2O中，取2~5 μl電泳。作PCR模板用。

此外也可使用市售細菌基因組DNA提取試劑盒獲得較純的基因組DNA。

B.從醫學標本或樣品中提取基因組DNA如果提供的材料是醫學標本或樣品則直接提取基因組DNA而不要培養，此方法如下:
液體標本高速離心(12000 r/min) 10min， 沉淀加50μl“標本預處理液"，37 °C 孵育30 min,12000r/ min離心10 min,沉淀待用;組織標本直接加等量“標本預處理液"，操作同上述。

處理后的標本加入30 μl專用裂解試劑(可購自北京美萊博醫學技術有限公司)，振蕩儀上振蕩5 min,使標本與試劑充分混合，然后煮沸10 min，使標本中的核酸物質che底釋放并溶解在緩沖液中;離心后上清即可進行PCR。

C.PCR擴增rDNA對已知的純培養的微生物可以設計特異引物，在GenBank搜索同種的菌種的rDNA序列，一般同種的 rDNA序列有99% 以上的-致性。設計好的引物通過BLAST比對驗證其特異性。
對醫學標本或樣品則可設計通用引物擴增目的16S rDNA。

如:
正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
反向引物5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

D.純化凝膠電泳檢測后 可使用PCR產物純化試劑盒純化擴增DNA。

（二）rRNA反轉錄法

A. 取16SrDNA序列的方法能夠區分被檢測的細胞是否為活體細胞。對未知序列的rRNA要測序，應該對目的rRNA進行純化。

B.以同源已知的rRNA序列為模板設計引物，RT-PCR獲得c-rDNA再測序。.

C.CDNA的合成。反轉錄體系共20μl,包括細胞總RNA 2 μg/2μl, 50 U/μl Rnasin 1 μl，5×反轉錄反應緩沖液4μl，10 mmol/L dNTPs 2μl，50 μg/ml 隨機引物2 μl，200 U/μl M-MLV反轉錄酶1μl, DEPC 8 μl。37 ℃反應60 min，95 °C 5 min終止反應。cDNA 在- 80 °C 保存或進行PCR擴增。

注意事項：如果實驗對象是純培養物，則可以按上述方法獲得rDNA后直接測序。對于從樣品標本中獲得的rDNA,需構建16S rDNA文庫，然后挑取單克隆測序。

注意事項

1.采用PCR技術可以一-次性從混合DNA或RNA樣品中擴增出16SrRNA序列，但也同樣會出現PCR所固有的缺點，尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物對多種微生物混合樣品進行擴增，可能出現嵌合產物(chimeric product)和擴增偏嗜性現象。

2.采用16SrRNA基因克隆文庫的方法分析菌群組成，既可以分析標本中細菌的種類，又可以反映標本中各種細菌的相對比例，可以相對定量。但不是絕對定量，即標本中菌群的比例與克隆文庫中對應單克隆的比例相關，但不是直線相關。

3.16SrDNA基因克隆文庫不能完quan反映標本的真實情況，有些細菌的比例太低，或有的細菌的rDNA不能用通用引物擴增出來而無法在克隆文庫中出現。前者可通過加大文庫量來解決，后者可通過設計兼并引物和多對引物同時使用部分解決。