全血RNA提取

原理

紅細胞裂解液選擇性裂解紅細胞,然后du特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解白細胞和滅活細胞RNA酶，然后用乙醇調節結合條件后，RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜， 再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。

材料與儀器

鮮血液
抗凝劑 紅細胞裂解液RLB 去蛋白液RW1 乙醇 漂洗液RW
制冰機 離心機 離心管 移液槍 移液管 針頭 注射器 水浴鍋

步驟

一、在適合大小的RNase free離心管中加入1體積（<1.5 ml）加入各種抗凝劑新鮮血液 (顛倒混勻后)和3體積的紅細胞裂解液RLB，顛倒混勻，可輕彈管壁，確保混勻。

二、室溫放置10分鐘（期間應該顛倒輕彈混勻數次幫助裂解紅細胞）。

如果RNA降解嚴重，可在冰上裂解，但是時間可長一些以充分裂解。

三、12 000 rpm離心20秒，倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細胞團），留下完整的管底白細胞團。

離心后在管底應該見到白色的白細胞團，也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細胞團，說明紅細胞裂解很不充分，應該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團后重復步驟二、三。

上清盡可能的吸棄，殘留過多會稀釋裂解液，造成裂解結合異常，產量純度降低。

四、渦旋或者輕彈管壁將白細胞沉淀wan全松散重懸，加入350 ul（<0.5 ml全血）或者600 ul（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT，吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。病人血樣中白細胞數量可能大幅增加，應該適當減少處理量。或者按照350 ul（<2x106白細胞）或者600 ul（2x106-1x107白細胞）比例加RTL。

五、用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9 mm針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產量。

六、較精確估計裂解物體積，加入等體積的70%乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!），此時可能出現沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

七、立刻將混合物(每次小于700 ul，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm離心60秒，棄掉廢液。

八、加700 ul 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12 000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

如果DNA殘留明顯，可在加入RW1后室溫放置5分鐘再離心。

九、加入500 ul漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500 ul漂洗液RW，重復一遍。

十、將吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

十一、取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50 ul RNase freewater（事先在 70-80℃水浴中加熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12 000 rpm 離心1分鐘。

十二、如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白細胞，加30-50 ul RNase free water重復步驟十一，合并兩次洗脫液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高，分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15-30%，但是濃度要低，用戶根據需要選擇。

注意事項

1. 第一次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入zhi定量無水乙醇。

2. 使用前將10X紅細胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X。

3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10 ul β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的RLT 4℃可放置一個月。

常見問題

1. 第一次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入zhi定量無水乙醇。

2. 使用前將10X紅細胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X。

3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10 ul β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的RLT 4℃可放置一個月。

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