qPCR的CT值為何定在15-35之間？

一、擴增曲線

擴增曲線是描述PCR動態進程的曲線，擴增曲線一般以循環數(Cycle number)為橫坐標,熒光強度(Fluorescence intensity)或信號量(Signal amount)為縱坐標。典型的擴增曲線可以分成四個時期：基線期、指數期、線性期和平臺期。

基線期：擴增曲線的水平部分，通常在PCR反應的前幾個循環（3-15個循環）內。此階段擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物生成量的變化。儀器軟件會基于這階段的熒光信號計算出基線范圍。

指數期：PCR擴增的指數增長階段，擴增曲線起峰。此時期所有反應試劑均有盈余，DNA聚合酶保持高水平的活力，每個循環的產物量與初始模板量符合指數關系。這是進行定量分析的最佳時期，因為PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系。

線性期：隨著原料的消耗、產物的積累、酶活的損耗等，DNA的擴增不再呈指數擴增，熒光信號的增長也逐漸放緩，反應效率降低。產物量與初始模板量不再符合指數關系。

平臺期：由于底物耗盡、酶活性降低等因素，熒光信號不再增加，趨于平穩。每個反應進入平臺期的時間和平臺期的高低各不相同。

二、熔解曲線

熔解曲線（Dissociation curve）是隨溫度升高DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線。它用于分析PCR產物的濃度、特點和純度。

原理：PCR反應結束后，通過逐漸增加溫度同時監測每一步的熒光信號來產生熔解曲線。隨著溫度上升，DNA雙鏈逐漸解開，熒光染料從雙鏈中釋放出來，熒光信號降低。當溫度達到DNA雙鏈解鏈50%時，對應的溫度稱為熔解溫度（Tm）。

曲線分析：

單峰曲線：如果qPCR產物非常特異，熔解曲線在80-90℃之間會形成一個單峰。這表明只擴增到了目的基因，沒有非特異性擴增產物。

前置雜峰：在主峰前有一個前鋒，可能是比目的片段短些的非特異性片段，在溫度低一些的時候就能解開雙鏈，也可能是引物二聚體。

后置雜峰：躲在主峰后面的是比目的片段長些的非特異性片段，在溫度高一些的時候才能解開雙鏈。

寬峰：如果非特異性產物Tm值與目的條帶的Tm值接近，熔解曲線可能出現寬峰。

擴增循環數（Cycle Threshold，Ct）在qPCR（實時熒光定量PCR）中是一個關鍵參數，代表PCR擴增過程中，熒光信號達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環數。

三、Ct值的定義

Ct值：全稱為Cycle Threshold，即在PCR反應中，每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。簡單來說，就是熒光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。

Ct值的意義與范圍

Ct值與模板量的關系：衡量PCR擴增過程中熒光信號達到設定閾值的循環次數。? Ct值越小，表示樣本中靶標核酸的起始拷貝數越多；Ct值越大，則表示起始拷貝數越少?Ct值與起始模板量的對數存在線性關系。

Ct值的范圍：在正常情況下，Ct值的范圍通常在15-35之間。Ct值小于15可能意味著擴增在基線期范圍內，未達到熒光閾值；而Ct值大于35則可能意味著模板起始拷貝數過低，擴增效率不佳或存在非特異性擴增，結果無意義。

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