PCR和凝膠電泳實驗結果常見的問題及原因分析

　　為了排除某些因素對PCR結果的影響，PCR實驗需要對照實驗。PCR的陽性對照是Marker，推測PCR產物長度，判斷PCR產物是否是目的片段。PCR的陰性對照是PCR的空白管，除了模板不加之外，其成分與其他管一樣，證明沒有其他模板污染。下面讓我們一起來看看PCR和凝膠電泳實驗結果常見的問題及原因分析吧！
 

　　一、耗材選擇不當對實驗結果造成很大的影響
 

　　PCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材質，因其為生物學惰性材料，表面不易于粘附生物分子，且有著良好的化學耐性，及溫度耐受性。這些材料通常會與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產制備過程中需要選用高質量的材料和良好的加工工藝。
 

　　PCR管的體積大多數都可以滿足PCR反應要求。但是在滿足實驗要求的基礎上，優先推薦選用低容管。因為低容反應管有著較小的上方空間，可提高熱傳導率并降低蒸發。而且在加樣時，需要避免加樣過量或過少。過量會導致熱傳導率下降，溢出及交叉污染，而加樣過少可能會造成樣品蒸發損失。
 

　　二、假陰性(無擴增產物)——現象：陽性對照有條帶，而樣品則無
 

　　原因：模板含有抑制物，含量低；緩沖液(Buffer)對樣品不合適；引物設計不當或者發生降解；反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短。
 

　　對策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量；更換Buffer或調整濃度；重新設計引物(避免鏈間二聚體和鏈內二級結構)或者換一管新引物；降低退火溫度、延長延伸時間。
 

　　三、非特異性擴增——條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶
 

　　原因：引物的特異性不強、提取模板DNA中可能會有非靶基因性同源序列；模板或引物濃度過高；酶量過多；Mg2+濃度偏高；退火溫度偏低；循環次數過多。
 

　　對策：重新設計引物；適當降低模板或引物濃度；適當減少酶量；降低鎂離子濃度；適當提高退火溫度則減少與同源性非靶DNA的互補程度；減少循環次數。四、拖尾——產物在凝膠上呈模糊不清狀態(彌散)
 

　　原因：模板不純；引物濃度不夠優化；Buffer不合適；退火溫度偏低；酶量過多；dNTP、Mg2+濃度偏高；循環次數過多。
 

　　對策：純化模板；對引物進行梯度稀釋；更換Buffer；適當提高退火溫度；適量用酶；適當降低dNTP和鎂離子的濃度；減少循環次數。
 

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