雙熒光素酶實驗的注意事項有哪些？

雙螢光素酶報告基因通常以螢火蟲螢光素酶為報告基因，以海腎螢光素酶為內參基因，如此所構成的報告系統有檢測靈敏度高、動態范圍廣、內參平衡等優勢，因此在實驗中得到廣泛應用。那么你知道雙熒光素酶實驗的注意事項有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、熒光值過高

熒光值過高可能會超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：

1.減少質粒轉染量；

2.細胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或對裂解產物進行稀釋后檢測。

（注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實的表達水平，否則會造成檢測結果出現大的偏差。）

二、熒光值過低或無熒光值

1. 啟動子活性低

a.優化細胞的培養條件，提高熒光素酶的表達量；

b.更換強啟動子（如SV40、CMV）。

2. 轉染效率低

a.優化轉染實驗條件，用較易轉染的質粒做陽性對照（如轉染過表達熒光蛋白質粒）；

b.確保轉染DNA的質量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質量進行鑒定；

c.選擇活性較高，處于指數分裂期的細胞進行轉染。

3. 樣品裂解效率低

a.細胞培養時間不宜過長，12-36h內最好，長時間培養后，細胞可能會難裂解；

b.加入的裂解液需足量，保證細胞能夠充分裂解。

4. 熒光信號衰減

熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內完成。

5. 底物氧化失效

a.底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；

b. 反應工作液建議現用現配。

三、如何判斷轉染成功

1. 如轉入的miRNA帶熒光標記如GFP，則可直接在轉染后、細胞裂解前，顯微鏡下觀察細胞熒光；

2. 如轉入的miRNA不帶任何熒光標記，可考慮進行miRNA的qRT-PCR檢測，通過檢測結果判斷實驗組2、4、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達；

3.設置一個熒光質粒轉染參照組，同批轉染一個組的細胞，間接反映出同批次實驗的轉染情況。

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