熒光原位雜交（FISH）的實驗步驟是什么？

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是 20 世紀 80 年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。那么你知道熒光原位雜交（FISH）的實驗步驟是什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、實驗材料準備

1. 實驗用具及材料

（1）人的 MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色體細胞標本；

（2）指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫 20 等；

（3）恒溫水浴鍋、培養箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400 熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等。

二、實驗方法及步驟

1. 探針變性

將探針在 75℃恒溫水浴中溫育 5 min，立即置 0℃，5～10 min，使雙鏈 DNA 探針變性。

2. 標本變性

（1）將制備好的染色體玻片標本于 50℃培養箱中烤片 2～3 h。（經 Giemsa 染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片標本，將其浸在 70～75℃的體積分數 70% 甲酰胺/2×SSC 的變性液中變性2～3 min。

（3）立即按順序將標本經體積分數 70%、體積分數 90%和體積分數 100%冰乙醇系列脫水，每次 5 min，然后空氣干燥。

3. 雜交

將已變性或預退火的 DNA 探針 10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上 18×18 蓋玻片，用 Parafilm 封片，置于潮濕暗盒中 37℃雜交過夜（約 15～17 h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態，此過程在濕盒中進行。

4. 洗脫

此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低本底。

（1） 雜交次日，將標本從 37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2） 將已雜交的玻片標本放置于已預熱 42～50℃的體積分數 50%甲酰胺/2×SSC 中洗滌3 次，每次 5 min。

（3） 在已預熱 42～50℃的 1×SSC 中洗滌 3 次，每次 5 min。

（4） 在室溫下，將玻片標本于 2×SSC 中輕洗一下。

（5） 取出玻片，自然干燥。

（6） 取 200 μL 復染溶液（PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液）滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

5. 雜交信號的放大（適用于使用生物素標記的探針）

（1） 在玻片的雜交部位加 150 μL 封閉液 I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育 20min。

（2） 去掉保鮮膜，再加 150 μL avidin-FITC 于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續溫育 40 min。

（3） 取出標本，將其放入已預熱 42～50℃的洗脫液中洗滌 3 次，每次 5 min。

（4） 在玻片標本的雜交部位加 150 μL 封閉液 II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育 20 min。

（5） 去掉保鮮膜，加 150 μL antiavidin 于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育 40 min。

（6） 取出標本，將其放入已預熱 42～50℃的新洗脫液中，洗滌 3 次，每次 5 min。

（7） 重復步驟（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室溫清洗一下。

（8） 取出玻片，自然干燥。

（9） 取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

6. 封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有 Mowiol（可使封片液產生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持數月之久。

7. 熒光顯微鏡觀察 FISH 結果

先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發光源，FITC 的激發波長為490 nm。細胞被 PI 染成紅色，而經 FITC 標記的探針所在的位置發出綠色熒光。

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